Обязательная процедура почти в каждом исследовании по молекулярной биологии — это выделение нуклеиновых кислот (НК). Секвенирование, амплификация и выполнение других подобных задач невозможно без предварительной экстракции НК.

Нередко от чистоты выделенных нуклеиновых кислот зависит результат всего исследования. Ключевые факторы успешного ДНК-анализа: правильная подготовка материалов и грамотный выбор технологии. В этой статье мы поговорим о современных методах выделения нуклеиновых кислот, их преимуществах и недостатках.

Фенол-хлороформная экстракция

Вот уже более 50 лет эта технология остается одной из самых используемых при экстракции НК. Фенол активно денатурирует белки, а при соединении с хлороформом и изоамиловым спиртом в соотношении 25:24:1 эффективно инактивирует РНКазы. В результате смешивания и центрифугирования получают двухфазный раствор. Первая (верхняя) фаза — водная, в которой содержатся нуклеиновые кислоты. Вторая (нижняя) — органическая со всеми жирами и липидами. Экстракция ДНК происходит из верхней (водной) фазы.

Преимущества технологии:

Нет необходимости в использовании сложного лабораторного оснащения
Невысокие финансовые затраты

Недостатки:

Процесс не автоматизирован и отличается значительными временными затратами
Полученные НК часто нуждаются в дополнительной очистке
Возможна потеря образца

Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК характеризуется значительно меньшим выходом нуклеиновых кислот, если сравнивать с другими современными технологиями.

Выделение на спин-колонках

Методика применяется более 40 лет и заключается в выделении нуклеиновой кислоты на силикатных частицах. При повышенной концентрации соли и в щелочной среде ДНК соединяется с силикой, что дает возможность убрать ненужные вещества. Во время центрифугирования ДНК остается на спин-колонке, а все лишнее устраняется.

Преимущества методики:

Более простой способ экстракции в сравнении с фенол-хлороформным выделением
Высокое качество и чистота полученной нуклеиновой кислоты

Недостатки:

Иногда экстракция коротких фрагментов ДНК при помощи силики затруднена
Множество манипуляций способно привести к загрязнению образца

Стоимость использования спин-колонок выше, чем предыдущей технологии. Это связано с тем, что каждая реакция требует отдельной колонки, нескольких пробирок и реагентов.

Экстракция на магнитных микроносителях

Суть этого метода выделения ДНК из крови заключается в связывании НК со специальным веществом (сефадексом, целлюлозой, dT-олигонуклеотидами и т. д.), которое покрывает магнитные микроносители. Клеточный лизат соединяют с магнитными частицами, после чего пробирку подносят близко к магниту либо устанавливают в магнитный штатив. В результате происходит агрегирование частиц. После отбора супернатанта НК элюируют.

Преимущества:

Для работы не нужна центрифуга и другое подобное оборудование
Органические растворители, осаждение на колонках и вакуумная фильтрация тоже не нужны
Многоэтапное центрифугирование отсутствует, поэтому процесс длится меньше времени, чем при других вышеупомянутых методах
При желании процедуру можно автоматизировать

Недостатки:

При использовании данного способа экстракции ДНК есть вероятность потери образца

Цена магнитной сепарации может быть выше, чем при использовании спин-колонок.

Умная экстракция

Протокол получил распространение в 2005 году. Для получения чистой нуклеиновой кислоты берут наконечники с немагнитными частицами, имеющими «умную» поверхность. В эти наконечники происходит сбор клеточного лизата, во время чего НК соединяется с немагнитными частицами. После промывки и элюции выделяется высококачественная нуклеиновая кислота.

Преимущества технологии:

Процесс экстракции существенно ускорен
Очень высокое качество нуклеиновой кислоты

Наконечники можно использовать и для стандартных дозаторов, и для станций, работающих автоматически. Поэтому такой способ выделения ДНК из слюны или крови очень просто автоматизировать.

Ферментативная температурно-зависимая экстракция

Технология основана на использовании наборов для экстракции производителя MicroGEM. Первый этап процедуры — соединение ферментов и буфера с имеющимся образцом. После этого происходит инкубация, во время которой клеточные стенки деградируются гидролазами. Затем пробирку нагревают, чтобы активированная протеиназа ЕА1 разрушила белки и высвободила НК. Когда температура достигнет 95°C, образец полностью готов.

Преимущества:

Нет потери нуклеиновой кислоты, поэтому метод подходит даже при наличии небольшого количества биоматериала
Процесс можно автоматизировать
Время экстракции — от 7 минут (это самый быстрый способ выделения среди вышеуказанных)
Невысокая цена

Среди недостатков можно упомянуть невысокий уровень очистки. Тем не менее образец пригоден для последующего применения в секвенировании, ПЦР и STR.

Современные методы выделения ДНК: высокое качество и производительность

Экстракция НК — одна из основных технологий в молекулярной биологии. Раньше протокол выделения нуклеиновых кислот был трудозатратным и занимал много времени, а полученные образцы не всегда отличались высоким качеством. Сегодня есть большое количество прогрессивных методов, которые дают возможность получать высокоочищенную НК.

Автоматизированные системы, разрабатываемые для лабораторий, — отличная альтернатива ручному процессу. Точность, скорость и качество анализа при выделении ДНК из растений, крови или слюны с использованием этих систем будут высокими, а риск кросс-контаминации — минимальным.