Обов’язкова процедура майже в кожному дослідженні з молекулярної біології — це виділення нуклеїнових кислот (НК). Секвенування, ампліфікація та виконання інших подібних завдань неможливе без попередньої екстракції НК.
Нерідко від чистоти виділених нуклеїнових кислот залежить результат усього дослідження. Ключові фактори успішного ДНК-аналізу: правильна підготовка матеріалів і грамотний вибір технології. У цій статті ми поговоримо про сучасні методи виділення нуклеїнових кислот, їхні переваги та недоліки.
Фенол-хлороформна екстракція
Ось уже понад 50 років ця технологія залишається однією з найрозповсюдженіших для екстракції НК. Фенол активно денатурує білки, а при з’єднанні з хлороформом та ізоаміловим спиртом у співвідношенні 25:24:1 ефективно інактивує РНКази. У результаті змішування й центрифугування отримують двофазний розчин. Перша (верхня) фаза — водна, у якій містяться нуклеїнові кислоти. Друга (нижня) — органічна з усіма жирами та ліпідами. Екстракція ДНК здійснюється з верхньої (водної) фази.
Переваги технології:
- Немає потреби у використанні складного лабораторного обладнання
- Невисокі фінансові витрати
Недоліки:
- Процес не автоматизований і має значні витрати часу
- Отримані НК часто потребують додаткового очищення
- Можлива втрата зразка
Фенол-хлороформний метод екстракції ДНК характеризується значно меншим виходом нуклеїнових кислот, якщо порівнювати з іншими сучасними технологіями.
Виділення на спін-колонках
Методика застосовується понад 40 років і полягає у виділенні нуклеїнової кислоти на силікатних частинках. При підвищеній концентрації солі й у лужному середовищі ДНК з’єднується з силікою, що дає можливість прибрати непотрібні речовини. Під час центрифугування ДНК залишається на спін-колонці, а все зайве усувається.
Переваги методики:
- Ще простіший спосіб екстракції, якщо порівнювати з фенол-хлороформним виділенням
- Висока якість і чистота отриманої нуклеїнової кислоти
Недоліки:
- Іноді екстракція коротких фрагментів ДНК за допомогою силіки ускладнена
- Безліч маніпуляцій може призвести до забруднення зразка
Вартість використання спін-колонок вища, ніж попередньої технології. Це пов’язано з тим, що кожна реакція потребує окремої колонки, декількох пробірок і реагентів.
Екстракція на магнітних мікроносіях
Особливість цього методу виділення ДНК з крові полягає у зв’язуванні НК зі спеціальною речовиною (сефадексом, целюлозою, dT-олігонуклеотидами тощо), яка покриває магнітні мікроносії. Клітинний лізат з’єднують з магнітними частинками, після чого пробірку підносять близько до магніту або встановлюють у магнітний штатив. У результаті відбувається агрегування частинок. Після відбору супернатанта НК елююють.
Переваги:
- Для роботи не потрібна центрифуга й інше подібне обладнання
- Органічні розчинники, осадження на колонках і вакуумна фільтрація теж не потрібні
- Багатоетапне центрифугування відсутнє, тому процес триває менше часу, ніж при інших вищезазначених методах
- За бажанням процедуру можна автоматизувати
Недоліки:
- При застосуванні даного способу екстракції ДНК є ймовірність втрати зразка.
Ціна магнітної сепарації може бути вищою, ніж використання спін-колонок.
Розумна екстракція
Протокол набув поширення у 2005 році. Для отримання чистої нуклеїнової кислоти беруть наконечники з немагнітними частинками, що мають «розумну» поверхню. У ці наконечники здійснюється збір клітинного лізата, під час чого НК з’єднується з немагнітними частинками. Після промивання та елюції виділяється високоякісна нуклеїнова кислота.
Переваги технології:
- Процес екстракції істотно прискорений
- Дуже висока якість нуклеїнової кислоти
Наконечники можна використовувати і для стандартних дозаторів, і для станцій, що працюють автоматично. Тому такий спосіб виділення ДНК зі слини або крові дуже просто автоматизувати.
Ферментативна температурно-залежна екстракція
Технологія заснована на використанні наборів для екстракції виробника MicroGEM. Перший етап процедури — з’єднання ферментів і буфера з наявним зразком. Після цього здійснюється інкубація, під час якої клітинні стінки деградуються гідролазами. Потім пробірку нагрівають, щоб активована протеїназа ЕА1 зруйнувала білки та вивільнила НК. Коли температура досягне 95°C, зразок повністю готовий.
Переваги:
- Немає втрати нуклеїнової кислоти, тому метод підходить навіть за наявності невеликої кількості біоматеріалу
- Процес можна автоматизувати
- Час екстракції — від 7 хвилин (це найшвидший спосіб виділення серед вищевказаних)
- Невисока ціна
Серед недоліків можна згадати невисокий рівень очищення. Проте зразок придатний для подальшого застосування в секвенуванні, ПЛР та STR.
Сучасні методи виділення ДНК: висока якість і продуктивність
Екстракція НК — одна з основних технологій у молекулярній біології. Раніше протокол виділення нуклеїнових кислот був трудомістким і потребував значних витрат часу, а отримані зразки не завжди вирізнялися високою якістю. Сьогодні є безліч прогресивних методів, які дають можливість отримувати високоочищену НК.
Автоматизовані системи, що розробляються для лабораторій, — чудова альтернатива ручному процесу. Точність, швидкість та якість аналізу при екстракції ДНК з рослин, крові або слини з використанням цих систем будуть високими, а ризик перехресної контамінації — мінімальним.