Большинство исследований в молекулярной биологии используют выделенные нуклеиновые кислоты для проведения тех или иных экспериментов. При этом, чистота и качество образцов, например, РНК — крайне важна, ведь от этого напрямую зависит результат исследования. Существуют разные технологии и методы выделения РНК, которые могут отличаться по принципу действия и типу биологического материала. В этом материале собрали для вас несколько методов выделения РНК, которые помогут вам в решении ваших задач.

В большинстве случаев пробоподготовка к биохимическим и диагностическим исследованиям начинается с экстракции нуклеиновых кислот. Такие процессы, как, например, амплификация методом ПЦР, секвенирование, обратная транскрипция или синтез ДНК проводятся только на образцах выделенной и очищенной НК. Получить максимально качественные и чистые образцы нуклеиновой кислоты для анализа крайне важно, ведь примеси белков и других органических веществ могут исказить результат.

Ингибиторы, которые могут влиять на чистоту образца РНК

Плохая очистка РНК от веществ, которые содержались в исходном биологическом материале, может стать причиной ингибирования реакции при проведении анализа методом ПЦР. Эти вещества могут повлиять на структуру фермента и существенно снизить его активность, или и вовсе деактивировать.

Ингибиторы могут оказаться в растворе РНК по нескольким причинам:

образцы были плохо очищены от органических веществ в материале, из которого осуществлялась экстракция. Это могут быть белки, углеводы, остатки жиров и пигментов. Если нуклеиновые кислоты выделяли из растительных клеток, ингибиторами в этом случае могут быть, например, хлорофиллы, антоцианы. Также в качестве агентов, задерживающих реакцию, могут быть вещества транспортной среды — формальдегид или гепарин.
образцы были плохо очищены от реагентов, которые использовались при выделении нуклеиново кислоты. Например, от спиртов, денатурантов, мочевины, ПАВ.

Метод фенол-хлороформного выделения

Этот метод выделения РНК наиболее широко используется из-за своей относительной дешевизны. Экстракция по этой технологии происходит в несколько этапов:

Получение лизата. В процессе лизирования клетки расщепляются на фрагменты, содержащие частицы клеточной стенки и внутриклеточного содержимого;
Инактивация нуклеаз;
Выделение необходимой нуклеиновой кислоты.

Экстракция НК с помощью смеси фенол-хлороформа — самый старый из известных методов выделения РНК. Фенол полностью денатурирует остатки белков в образце, но при этом только частично инактивирует РНКазы. Чтобы решить эту проблему, к фенолу и хлороформу добавляют изоамиловый спирт в пропорции 25:24:1, а потом смешивают с лизатом и помещают в центрифугу. В результате получается двухфазный раствор, в котором все органические примеси и белки оседают (гидрофобный слой), а искомая РНК — всплывает на поверхность (гидрофильный слой). Далее отбирают содержащую РНК верхнюю фазу, добавляют этанол или изопропанол в пропорции 2:1 или 1:1, чтобы осадить РНК из супернатанта.

Как уже отметили, преимущество этого метода в его относительно невысокой стоимости, так как не требуется дополнительное оборудование. Однако полученный в результате образец нуклеиновой кислоты — не очень высокого качества, поэтому требуется дополнительная очистка.

Метод выделения РНК на спин-колонках

В основе метода — свойство нуклеиновых кислот при определенных условиях связываться с силикатами. Это позволяет сепарировать компоненты клетки от частиц силики со связанными нуклеиновыми кислотами. Это свойство НК было открыто еще в конце 1970-х, в результате чего была разработана технология экстракции нуклеиновых кислот на силикатных носителях. Экстракция на спин-колонках — более современный и усовершенствованный метод выделения нуклеиновых кислот.

Конструкция спин-колонки продумана таким образом, что при нанесении на нее клеточного лизата и дальнейшего центрифугирования, РНК остается на ней, а остальные фрагменты клетки — отсеиваются. После этого нуклеиновую кислоту несколько раз промывают, а затем — извлекают в пробирку для сбора образца для исследования.

Образец РНК, полученный в результате применения этого метода, отличается чистотой и качеством. Но, в сравнении с предыдущим описанным методом, он значительно дороже.

Метод ферментативной температурно-зависимой экстракции

Для всех описанных выше способов выделения нуклеиновой кислоты лимитирующим фактором является этап лизиса. Для разрушения клеточных стенок во всех технологиях применяется додецилсульфат натрия (SDS) и протеиназа К. Дело в том, что эти вещества — ингибиторы, которые могут замедлять полимеразную цепную реакцию. Чтобы получить максимально чистый образец для исследования, выделенную РНК необходимо несколько раз промыть, а это, в свою очередь, повышает риск контаминации и может вовсе привести к потере образца.

Решение этой проблемы нашли новозеландские ученые. Чтобы минимизировать воздействие химикатов, используемых для экстракции нуклеиновой кислоты, на качество образца, они решили использовать термофильную протеиназу ЕА1 в сочетании с мезофильными гидролазами.

Как работает метод ферментативной температурно-зависимой экстракции?

Смешивают образец с буфером и ферментами
Дальнейшая инкубация при комнатной температуре, в процессе которой гидролазы разрушают стенки клеток
Разрушение белков и высвобождение РНК в результате активации работы протеиназы ЕА1 путем нагревания пробирки со смесью до 75°С
Чтобы получить готовый для дальнейших исследований образец РНК, необходимо деактивировать ЕА1. Для этого пробирку нагревают до 95°С

От предыдущих методов выделения РНК, ферментативную температурно-зависимая экстракцию можно автоматизировать. Использование этой технологии позволяет получить высокоочищенные образцы нуклеиновой кислоты за максимально короткое время — до 7 минут.

Метод выделения НК на магнитных частицах

На данный момент благодаря быстроте исполнения и возможности автоматизации процесса особой популярностью пользуется метод выделения НК на магнитных частицах.

Технология его основана на связывании НК с веществом,которое покрывает магнитные частицы. В лизированный образец добавляют магнитные частицы и перемешивают.Потом фиксируют твердую фазу,поднося пробирки с образцом к магниту или ставя их в магнитный штатив. Затем отбирают супернатант (надосадок), а НК промывают и элюируют.

Несомненным плюсом этого метода является тот факт что для его проведения совершенно не требуется сложное оборудование.

Перечисленные в статье методы выделения РНК — лишь незначительная часть технологий, применяемых сегодня для экстракции нуклеиновых кислот в процессе пробоподготовки. Кроме этого, на рынке доступно множество готовых решений, которые позволяют подготовить качественные образцы для анализа прямо “из коробки”. В сравнении с традиционными методами экстракции НК, использование готовых наборов позволяет значительно сократить время и трудозатраты на подготовку проб, а также исключить возможные ошибки из-за “человеческого фактора”.