SARS-CoV-2 и обоняние: как происходит потеря нюха?

Аносмия или потеря обоняния распространенный и порой единственный симптом COVID-19. Она может быть полной или частичной. Группа ученых из разных стран попыталась определить последовательность событий, ведущих к обонятельной дисфункции (см. журнал Cell). В качестве исследуемого материала использовали образцы слизистой органов дыхания от 85 пациентов, которые умерли через несколько дней после заражения SARS-CoV-2. Исследования показали, что именно поддерживающие клетки являются основным мишенями для SARS-CoV-2, в то время как обонятельные нейроны вирусом не поражаются. 

Рис. 1. Cхема попадания вируса SARS-CoV-2 в организм человека.

Рис. 1. Cхема попадания вируса SARS-CoV-2 в организм человека.

На Рис. 1 представлена визуальная схема попадания вируса SARS-CoV-2 в организм человека. Основное место поражения дыхательный эпителий, в реснитчатых клетках которого вирус реплицируется. Базальные и бокаловидные клетки при этом остаются нетронутыми. Исследовав взятые образцы, ученые не нашли доказательств инфекции обонятельных сенсорных нейронов. Паренхима обонятельной луковицы, через которую вирус попадает в ткани мозга, тоже не пострадала. Но вирус был найден в покрывающих ее оболочках: паутинной и мягкой.

Таким образом, ученые пришли к выводу, что SARS-CoV-2 не является нейротропным вирусом. 

COVID-19 или ОРВИ?

Высокая температура, кашель, насморк – реакции присущи как для ОРВИ, так и для COVID-19. Без теста различить эти два заболевания практически невозможно. Но есть симптомы, наличие которых характерно больше для коронавирусной инфекции.

Обонятельная дисфункция была обнаружена на ранней стадии пандемии COVID-19 и является сильным и практически постоянным симптомом. Согласно исследованиям у 25% заболевших аносмия оказывается первым симптомом. И примерно у 50% данный признак возникает по ходу заболевания. На первый взгляд отсутствие нюха не является опасным, но чаще всего длится достаточно долго и несет определенный дискомфорт. В том числе может повысить вероятность пищевого отравления.

Структура слизистой оболочки полости носа

Слизистую оболочку полости носа формируют две области: дыхательная и обонятельная.

Эпителий дыхательной области покрыт такими клетками:

  • бокаловидные клетки, отвечающие за выделение слизи;
  • реснитчатые клетки, способствующие эффективному продвижению слизи и секреции попавших в нее патогенов;
  • базальные клетки, восстанавливающие слизистую оболочку.

Далее размещена базальная мембрана и Lamina propria: собственная пластинка.

Обонятельная область представлена небольшими островками и значительно меньше дыхательной. Состоит она из:

  • обонятельных нейронов;
  • поддерживающих клеток;
  • базальных клеток.
Рис. 2 Пахучие молекулы проникают в полость носа и дендриты обонятельных нейронов улавливают их наличие

Рис. 2 Пахучие молекулы проникают в полость носа и дендриты обонятельных нейронов улавливают их наличие

На Рис. 2 показано как пахучие молекулы проникают в полость носа и дендриты обонятельных нейронов улавливают их наличие. Далее через аксоны обонятельных нейронов сигнал проходит в обонятельную луковицу, где происходит формирование синапсов с митральными клетками. А уже через них сигнал попадает в первичную обонятельную кору, миндалину и гипоталамус. Появляется ощущение запаха, а также возникают реакции и эмоции, связанные с ним.

Влияние SARS-CoV-2 на обонятельную систему

Хотя потеря нюха является частой и характерной реакцией при COVID-19, механизм полного развития данного симптома все же остается для ученых загадкой. Один из наиболее очевидных факторов воспалительный процесс слизистой оболочки полости носа. Ведь SARS-CoV-2 чаще всего проникает в организм через клетки дыхательного эпителия. Но тут возникает вопрос по поводу того, что происходит с обонятельным эпителием? Чтобы попасть в клетку для вируса требуется наличие рецептора АСЕ2 и протеазы TMPRSS2. Рецепторы ACE2 имеются на поверхности клеток разных органов (сюда относится и центральная нервная система). Исходя из этого, вирус вероятно способен поражать не только обонятельные нейроны, но и сами клетки обонятельной луковицы.

В 2020 году было опубликовано исследование, где раскрывалась тема возможности проникновения SARS-CoV-2 в обонятельную систему (Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia). Прибегнув к анализу опубликованных результатов секвенирования РНК отдельных клеток обонятельного эпителия, ученые обнаружили, что в основном экспрессия белка АСЕ2 происходит в базальных, поддерживающих клетках и в клетках, которые окружают кровеносные сосуды. В нейронах экспрессию АСЕ2 обнаружено не было. Дальнейшие сопутствующие исследования проводились на мышах, поэтому, чтобы подтвердить наблюдение относительно SARS-CoV-2 и нейронов, необходимы были эксперименты с биопсией зараженных пациентов.  Этот метод использовали ученые из США, Бельгии и Германии, по итогам их экспериментов и опубликована статья в журнале Cell

Процесс проведения исследования

Сложность состояла в том, что обонятельная луковица у живого человека труднодоступна и взятие образца сопровождалось бы разрушением решетчатой пластинки решетчатой кости. Поэтому, для получения достоверного результата, биопсию требовалось брать post mortem, то есть у умерших пациентов. Для этого учеными был разработан специальный протокол, позволяющий незамедлительно получить образцы до момента разрушения клеток.

После фиксации смерти пациента, давшего согласие на участие в эксперименте, срочно проводилась биопсия. Для взятия материала использовалась та же эндоскопическая система, что и при операции на черепе. Таким образом были получены 85 образцов: 68 от умерших от COVID-19, 15 образцов взяли у контрольных пациентов и 2 у пациентов, которые переболели коронавирусной инфекцией, но умерли позже от других заболеваний. 

Первая задача, которая возникала после получения образцов, визуализировать разные типы клеток в слизистых обонятельной луковицы и обонятельной области. С этой целью был применен метод гибридизации РНК, который помог рассмотреть отдельные молекулы РНК на микрофотографии. А иммуногистохимическое окрашивание помогло увидеть как расположены белки.

Рис. 3. RNAscope и иммуногистохимический  анализ при исследовании образцов слизистой дыхательной и обонятельной областей, а также обонятельной луковицы

Рис. 3. RNAscope и иммуногистохимический  анализ при исследовании образцов слизистой дыхательной и обонятельной областей, а также обонятельной луковицы

На Рис. 3 представлен RNAscope и иммуногистохимический  анализ при исследовании образцов слизистой дыхательной и обонятельной областей, а также обонятельной луковицы. Мы видим respiratory mucosa – слизистую дыхательной области, olfactory mucosa – слизистую обонятельной области и olfactory bulb – обонятельную луковицу. Чтобы изучить морфологию образцов, для окрашивания использовали гематоксилин и эозин (верхний ряд). В нижнем ряду приведены изображения, которые получили используя конфокальный микроскоп. Белым цветом помечены ядра клеток. Остальными цветами акцентированы такие маркеры:

  • в слизистой дыхательной области: мРНК гена FOXJ1 (маркер клеток мерцательного эпителия, выделен зеленым); белок EPCAM (принадлежащий эпителиальным клеткам, выделен красным) и белок MUC5AC (принадлежащий бокаловидным клеткам, выделен синим);
  • в слизистой обонятельной области: мРНК гена OR5A1 (обонятельный рецептор, выделен зеленым), мРНК гена OMP (выделен красным) и белок KRT8 (выделен синим);
  • в обонятельной луковице: белок SSTR2A (маркер мягкой и паутинной оболочек головного мозга, выделен зеленым) и белок TUBB3 (экспрессируется в нейронах, выделен синим).

Определить наличие SARS-CoV-2 в клетках – вторая задача, которая стояла перед учеными. Решили ее также с помощью зонда RNAscope. Из 68 пациентов у 30 был обнаружен вирус. Все случаи, за исключением одного, “информативные”: пациентам был диагностирован COVID-19 за 16 дней до смерти. В слизистой дыхательной области вирус наблюдался в реснитчатых клетках и, в редких случаях, в клетках выстилки протоков желез слизистой. А в трех случаях это были единственные клетки с вирусом.

Общая картина распределения SARS-CoV-2 в слизистой дыхательной области умерших от COVID-19 представлена на Рис. 4.

Общая картина распределения SARS-CoV-2 в слизистой дыхательной области умерших от COVID-19

Рис. 4. Общая картина распределения SARS-CoV-2 в слизистой дыхательной области умерших от COVID-19

Вирус SARS-CoV-2 был обнаружен в слизистой обонятельной области у 6 “информативных” случаев. Для детального изучения распределения вируса, ученые использовали различные маркеры обонятельных нейронов: мРНК ANO2, CNGA2, GNAL, GNG13, OMP, гены обонятельных рецепторов и белок TUBB3.

Рис. 5

Рис. 5

Особенно значимая для исследования информация оказалась в данных, полученных от пациента №8, который умер от COVID-19 через четыре дня после подтверждения заболевания. Во взятых образцах было зафиксировано отсутствие следов нуклеокапсидного белка. Он присутствовал в основном в поддерживающих клетках (Рис. 5, D, E), которые экспрессируют маркерами ERMN и UGT2A1. SARS-CoV-2 снижает уровень транскрипции и трансляции клеток, поэтому интенсивность сигнала в зараженных клетках ниже. Как пример на Рис.5, F: поддерживающая клетка заполнена сигналом от нуклеокапсидного белка вируса и РНК SARS-CoV-2-orf1ab-sense, при этом в ней нет характерного для поддерживающих клеток сигнала от мРНК GPX3 (глутатион пероксидазы). 

В обонятельных нейронах признаки вируса обнаружены не были. На Рис. 5, G-I наблюдается присутствие во внешнем слое сигнала от вирусных РНК, который совпадает с клетками, где происходит экспрессия белка KRT8. Нижний слой клеток, соответствующий мРНК обонятельных рецепторов, располагается ниже и не совпадает с сигналом от вирусной РНК. Для подтверждения исследования был проведен анализ биопсии еще двоих пациентов. Результаты показали, что SARS-CoV-2 не инфицирует обонятельные нейроны.

Рис. 6

Рис. 6

Также исследовали образцы обонятельной луковицы. Как маркеры были использованы мРНК PECAM1 и два белка SSTR2A и TUBB3. В ходе исследования вирус все же был обнаружен (11 случаев из 30), но поражалась лишь мягкая оболочка головного мозга и выстелка сосудов. Паренхима обонятельной луковицы не повреждалась (Рис. 6).

Заключения

Проведя исследования, авторы сделали заключение, что SARS-CoV-2 не поражает обонятельные нейроны, а главная его мишень — поддерживающие клетки обонятельной области. И если учесть тот факт, что данные клетки выполняют многие функции (в том числе и не изученные), то их повреждение может приводить к нарушению работы нейронов.

Неспособность SARS-CoV-2 заражать нейроны все же достаточно сложный и спорный вопрос, так как существует ряд других научных работ, поднимающих вопрос проникновения вируса в нервную ткань. К примеру, исследования биологов из Америки (Neuroinvasion of SARS-CoV-2 in human and mouse brain).

Если вирус поражает поддерживающие клетки, то как это влияет на нейроны? И попадает ли вирус в головной мозг через них? Ряд вопросов все же остается открытым и требует дальнейшего изучения.