Визначення генотипу методом алельної дискримінації дозволяє встановити генотипи зразків автоматично. У приладах CFX та QuantStudio 5 він ґрунтується на аналізі відносної флуоресценції (RFU/∆Rn) між двома каналами (Allele 1 – FAM та Allele 2 – VIC).

Table of Contents

Програмування приладу

Відкрийте Bio-Rad CFX Dx і створіть новий протокол згідно з інструкцією з використання (ІЗВ) «Biocore® Синдром Жильбера»: File→New→Protocol (Рис. 1)
Рисунок 1
Перейдіть у вікно Plate→Edit Selected та налаштуйте планшет, запрограмувавши необхідні лунки та канали флуоресценції. У вкладці Type Sample оберіть позначки для контрольних зразків «Positive Control» та «NTC» (Рис. 2).
Рисунок 2
Завантажте реакційні стріпи в прилад та запустіть реакцію – START RUN.

Облік результатів

Після відкриття експерименту автоматично відображається вкладка із графіком ампліфікації (Quantification). Перевірте контрольні зразки візуально. Для цього у лінійному типі шкали оцініть криві ампліфікації, де у гомозиготних зразках висота флуоресценції одного з каналів вище за інший, тоді як у гетерозиготних обидві криві проходять на однаковому рівні. В негативних контрольних зразках – сигнал ампліфікації за каналами FAM та VIC відсутній (Рис. 3).

Увага! Якщо у дослідному зразку відсутній сигнал за каналом FAM та/або VIC – результат вважається невалідним і аналіз необхідно повторити, починаючи з етапу екстракції нуклеїнових кислот.

Для автоматичного обліку результатів програмним забезпеченням перейдіть у вкладку дискримінації алелів (Allelic Discrimination). Переконайтеся, що осі X та Y налаштовані відповідно до флуорофорів: X — FAM, Y — VIC.

Перевірте правильність контрольних зразків:

контрольний зразок дикого типу має відповідати точці на осі Allele 2 (синій колір);
контрольний зразок мутантний алель відповідає точці на осі Allele 1 (оранжевий колір);
контрольний зразок гетерозиготи знаходиться посередині (зелений колір);
негативний контрольний зразок знаходиться в лівому нижньому куті (чорний колір).

Дослідні зразки відображаються аналогічним чином (Рис. 4).

Рисунок 3

Рисунок 4

Якщо при автоматичній обробці даних негативний чи позитивний контрольний зразок оцінено некоректно або зразок відображається як «х» – результат невизначений*, то в панелі налаштувань (Select cycle) оберіть значення ≥35 циклу.

* Можливими причинами отримання невизначеного результату для зразка можуть бути неналежний забір біоматеріалу або помилки під час екстракції нуклеїнових кислот.

Якщо після внесення змін до налаштувань зразок став визначеним, обов’язково перевірте отриманий результат візуально за кривими ампліфікації у вікні Quantification.
Якщо після виконаних дій результат контрольного зразка досі не відповідає зазначеним вимогам / зразок все ще не визначений, то результат вважається невалідним і потребує повторного проведення.

Пропонуємо також ознайомитися з Інструкція з програмування та обробки результатів ПЛР-РЧ для набору діагностичного «Biocore® Синдром Жильбера» для приладу QuantStudio 5