Определение генотипа методом аллельной дискриминации позволяет установить генотипы образцов автоматически. В приборах CFX и QuantStudio 5 он основан на анализе относительной флуоресценции (RFU/∆Rn) между двумя каналами (Allele 1 — FAM и Allele 2 — VIC).
Программирование прибора
- Откройте Bio-Rad CFX Dx и создайте новый протокол в соответствии с инструкцией по использованию (ИИУ) «Biocore® Синдром Жильбера»: File→New→Protocol (Рис. 1).
Рисунок 1
- Перейдите в окно Plate→Edit Selected и настройте планшет, запрограммировав необходимые лунки и каналы флуоресценции. Во вкладке Type Sample выберите отметки для контрольных образцов «Positive Control» и «NTC» (Рис. 2).
Рисунок 2
- Загрузите реакционные стрипы в прибор и запустите реакцию — START RUN.
Учет результатов
После открытия эксперимента автоматически отображается вкладка с графиком амплификации (Quantification). Проверьте контрольные образцы визуально. Для этого в линейном типе шкалы оцените кривые амплификации, где в гомозиготных образцах высота флуоресценции одного из каналов выше другого, тогда как в гетерозиготных обе кривые проходят на одинаковом уровне. В отрицательных контрольных образцах – сигнал амплификации по каналам FAM и VIC отсутствует (Рис. 3).
Внимание! Если в исследуемом образце отсутствует сигнал по каналу FAM и/или VIC — результат считается недействительным и анализ необходимо повторить, начиная с этапа экстракции нуклеиновых кислот.
Для автоматического учета результатов программным обеспечением перейдите во вкладку дискриминации аллелей (Allelic Discrimination). Убедитесь, что оси X и Y настроены в соответствии с флуорофорами: X — FAM, Y — VIC.
Проверьте правильность контрольных образцов:
- контрольный образец дикого типа должен соответствовать точке на оси Allele 2 (синий цвет);
- контрольный образец мутантного аллеля соответствует точке на оси Allele 1 (оранжевый цвет);
- контрольный образец гетерозиготы находится посередине (зеленый цвет);
- отрицательный контрольный образец находится в левом нижнем углу (черный цвет).
Рисунок 3
Исследуемые образцы отображаются аналогичным образом (Рис. 4).
Рисунок 4
Если при автоматической обработке данных отрицательный или положительный контрольный образец оценен некорректно или образец отображается как «х» – результат неопределен*, то в панели настроек (Select cycle) выберите значение ≥35 цикла.
* Возможными причинами получения неопределенного результата для образца могут быть ненадлежащий забор биоматериала или ошибки при экстракции нуклеиновых кислот.
- Если после внесения изменений в настройки образец стал определенным, обязательно проверьте полученный результат визуально по кривым амплификации в окне Quantification.
- Если после выполненных действий результат контрольного образца по-прежнему не соответствует указанным требованиям / образец все еще не определен, то результат считается недействительным и требует повторного проведения.
Предлагаем также ознакомиться с Инструкция с программирования и обработки результатов ПЦР-РВ для набора диагностического «Biocore® Синдром Жильбера» для прибора QuantStudio 5